Makedonya Kralı İskender’in M.Ö. 333 yılında İssas savaşında Pers İmparatorluğuna son vermesi ve İran’ı istilâsı üzerine Makedonya Krallığının kontrolüne geçmişti. M.Ö.323 yılında İskender’in ölümü ile İmparatorluk 4 parçaya bölünmüş ve bu bölge, Asya Seleukoslar Devletinin payına düşmüştü. Daha sonra Komagene Krallığı, Pontus Krallığı, Partlar ve Sasanilerin kontrolüne geçen bölgeye bilahare Romalılar hâkim olmuştur.
Roma ordularının uğrak yeri haline gelen Malatya; kuzeyi güneye, doğuyu batıya bağlayan bir düğüm noktası üzerinde bulunuyordu. Fırat nehrinin doğu ile batıyı birbirinden ayırması, buranın önemini daha da artırmıştır. Bu bölgeye Romalılar iki lejyon yerleştirmiş; 12. Fulminita Lejyonunu Malatya’ya, 16. Flavia Lejyonunu Samosata’da (Adıyaman) görevlendirmiştir. Roma'nın 30 lejyonundan ikisini Fırat kıyısına yerleştirmesi bölgenin önemini gözler önüne sermektedir.
Malatya’ya yerleştirilen 12. lejyon doğudaki Roma'nın en önemli askeri üssü olmuştur. Bu lejyonlar bölgede asayişi sağlayarak, Karadeniz'den Zaugma'ya kadar uzanan doğu hudutlarının bekçisi olmuştur. Romalıların 12. Lejyonu buraya yerleştirmelerinin sebebi; buranın önemli bir yol kavşağında olması, Fırat'ın burada geçit vermesi, su kaynaklarının ve yiyecek depolarının bol olmasındandır. 12. lejyonun Malatya'da yerleştirilmesi ile Aslantepe'de bulunan şehrin yeri değiştirilerek, buranın 4. km. kuzeyinde bugün Battalgazi ilçesi adı verilen yere konuşlandırılmıştır. Şehrin etrafı M.S. 98 -117 yılları arasında, Traianus döneminde surlarla çevrilmiştir. Traianus zamanında Malatya, Part'lara karşı önemli bir sınır üssü olmuş, askeri yolların geçtiği bir geçit noktası haline gelmiştir.
Romalılar döneminde sınır şehri olma özelliğini taşıyan Malatya’ya, komşu devletler tarafından sürekli saldırılar olmuştur. Savaşlar sebebiyle yıpranan şehir surları, M.S. 363 yılında İmparator Constantius zamanında tamir ettirilerek, genişletilmiştir. Daha sonra bütün Roma ülkesinde olduğu gibi Malatya’yada da huzursuzluk ve isyanlar artmış, şehir sürekli olarak el değiştirmiştir. Pers kralı Şahpur'u Bizans imparatoru Valens’in yenmesi ile bölgede Roma nüfuzu yeniden sağlanmıştır. Romalılar tarafından askeri bir karargâh olarak kullanılan Malatya’nın, o dönemine ait eserler tahrip olduğundan, günümüze ulaşamamıştır.
Ulaşabilinen kültürel buluntular ve kalıntılar Malatya müzesinde sergilenmektedir. M.S. 395 yılında Roma imparatorluğu ikiye bölününce, Malatya da Doğu Roma yani Bizanssın Payına düşünce, Bizanslılar Malatya şehrini eyalet merkezi haline getirirler. Bizanslıların yönetiminde uzun yıllar kalan Malatya, sürekli olarak bir askeri üs olarak kullanılmış ve bu süre içerisinde surlar ve şehir yeniden onarılmıştır. Fulminita lejyonu adı verilen askeri karargâha Bizanslılar "Likandos" adını vermişlerdir. Bizans imparatoru Akilleon Eski Malatya'yı İmparatorluğun 12. temi olarak adlandır.
M.S. 532 yılında imparator Justinyanus zamanında ise, şehir surları yeniden restore edilerek, yeni koruganlarla çevrilmiş, şehir müstahkem bir hale getirilmiştir. Bizanslılar, Malatya’yı Romalılardan daha çok geliştirmişlerdir. Şehrin su ihtiyacı, bugün olduğu gibi Derme Suyu olarak bilinen Gündüzbey su kaynaklarından karşılanmıştır. Öte yandan Malatya’nın şehir içinde ve çevresinde bulunan kale kalıntılarından şehrin geniş bir alana yayıldığı ve Hıristiyanlaştırıldığı anlaşılmaktadır. Şehir ve çevresinde çok sayıda kilise ve manastır yaptırılmıştır. Ancak, bu mabetlerin büyük kısmı İslam-Bizans mücadelesi sırasında tahrip olduğundan, günümüze kadar gelememiştir. Bizanslılar, Malatya’yı Sasanilere karşı bir hudut şehri olarak kullanmaktaydılar. 575 yılının sonbahar mevsiminde Sasaniler’le Bizanslılar arasında büyük bir meydan savaşı olmuş, Sasani imparatoru I. Hüsrev yenilince, yenilgiyi hazmedemeyerek intikam amacı ile şehri yakıp yıkmıştır. Şehir daha sonra yeniden onarılmıştır.